鴨肝炎病毒（DHV）核酸檢測試劑盒（熒光RT-PCR法）
【產品名稱】
通用名稱：鴨肝炎病毒（DHV）核酸檢測試劑盒（熒光RT-PCR法）
【包裝規格】50T/盒
【預期用途】
鴨病毒性肝炎（Duck Virus Hepatitis，簡稱DVH），是由鴨病毒性肝炎（Duck Hepatitis Virus，簡稱DHV）引起、發生在鴨身上的一種病害。病鴨表現精神萎靡，不能隨群走動，眼睛半閉，打瞌睡。隨后病鴨不安定，出現神經癥狀，運動失調。鴨病毒性肝炎是病毒性傳染病，具有急性、高度致死性等特點。鴨病毒性肝炎逐漸成為危害養鴨業的重大疫病。本試劑盒適用于檢測肝臟組織或血液等樣本中的鴨肝炎病毒 ，適用于鴨肝炎病毒感染的輔助診斷。
【檢驗原理】
本試劑盒采用TaqMan探針法實時熒光PCR技術，設計1對鴨肝炎病毒特異性引物，結合1條特異性探針，用熒光PCR技術對鴨肝炎病毒的核酸進行體外擴增檢測，用于臨床上對可疑感染者的病原學診斷。
【試劑組成】
名 稱 | 規 格 |
DHV酶液 | 50μL×1管 |
DHV反應液 | 950uL×1管 |
DHV陽性質控品 | 50μL ×1管 |
陰性質控品 | 50μL ×1管 |
說明：不同批號的試劑盒組分不可交互使用。
【儲存條件及有效期】
-20℃±5℃，避光保存、運輸、反復凍融不超過5次，有效期12個月。
【適用儀器】
ABI 、安捷倫MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、eppendorf等系列熒光定量PCR檢測儀。
【標本采集】
病死或撲殺的鴨，無菌剪取肝臟樣品1g；生禽取血液樣品，抽取1ml血液進行測試。
【保存和運輸】
上述標本短期內可保存于-20℃，長期保存可置-70℃，但不能超過6個月，標本運送應采用2~8℃冰袋運輸，嚴禁反復凍融。
【使用方法】
1. 樣品處理（樣本處理區）
1.1 樣本前處理
組織樣品：每份組織分別從3個不同的位置稱取樣品約1g，手術剪剪碎混勻后取0.5g于研磨器中研磨，加入1.5mL生理鹽水后繼續研磨，待勻漿后轉至1.5mL滅菌離心管中，8000rpm離心2min，取上清液100μL于1.5mL滅菌離心管中；血液樣品直接取100μL于1.5mL滅菌離心管中。
1.2 RNA提取
為了使實驗結果穩定、有效、可靠，建議使用商品化的RNA提取試劑盒進行提取，嚴格按照對應試劑盒說明書進行操作。
2. 試劑配制（試劑準備區）
根據待檢測樣本總數，設所需要的PCR反應管管數為N(N=樣本數+1管陰性對照+1管陽性對照；樣品每滿7份，多配制1份)，每測試反應體系配制如下表：
試劑 | DHV反應液 | 酶液 |
用量（樣本數為N） | 19μL | 1μL |
3. 加樣（樣本處理區）
將步驟1提取的RNA、陽性質控品、陰性質控品各取5μL，分別加入相應的反應管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。
4. PCR擴增（核酸擴增區）
4.1 將待檢測反應管置于熒光定量PCR儀反應槽內；
4.2 設置好通道、樣品信息，反應體系設置為25μL；
熒光通道選擇： 檢測通道（Reporter Dye）FAM檢測鴨肝炎病毒，淬滅通道（Quencher Dye）NONE，請勿選擇ROX參比熒光。
4.3 推薦循環參數設置：
步驟 | 循環數 | 溫度 | 時間 | 收集熒光信號 |
1 | 1 cycle | 50℃ | 15min | 否 |
2 | 1 cycle | 95℃ | 3min | 否 |
3 | 45 cycles | 95℃ | 15sec | 否 |
55℃ | 30sec | 是 |
5. 結果分析判定
5.1 結果分析條件設定
設置Baseline和Threshold：一般直接按機器自動分析的結果分析，當曲線出現整體傾斜時，根據分析后圖像調節Baseline的start值(一般可在3~15范圍內調節)、stop值(一般可在5~20范圍內調節)，以及Threshold的Value值(上下拖動閾值線至高于陰性對照)，重新分析結果。
5.2 結果判斷
陽性：檢測通道Ct值≤38.0，且曲線有明顯的指數增長曲線。
可疑：檢測通道38.0<Ct值<40.0，且出現典型擴增曲線的樣本建議重復試驗，重復試驗結果出現Ct值<40.0且有典型擴增曲線者為陽性，否則為陰性。
陰性：樣本檢測結果無Ct值且無明顯的擴增曲線。
6. 檢測方法的局限性
? 樣本檢測結果與樣本收集、處理、運送以及保存質量有關；
? 樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現假陽性結果；
? 陽性對照、擴增產物泄漏，會導致假陽性結果；
? 病原體在流行過程中基因突變、重組，會導致假陰性結果；
? 不同的提取方法存在提取效率差異，會導致假陰性結果；
? 試劑運輸，保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降，出現假陰性或定量檢測不準確的結果；
? 本檢測結果僅供參考，如須確診請結合臨床癥狀以及其他檢測手段。
7. 質控標準
陰性質控品：無明顯擴增曲線且無Ct值顯示；
陽性質控品：擴增曲線有明顯指數生長期，且Ct值≤30；
以上條件應同時滿足，否則實驗視為無效。
8. 性能指標
（1）敏感性：內控樣本敏感性為100%，綜合評價敏感性98%以上。最低檢測限不低于1000copies/ml。
（2）特異性：100%。
（3）穩定性：批內及批間差異≤3%。
【注意事項】
? 所有操作嚴格按照說明書進行；
? 試劑盒內各種組分使用前應自然融化，完全混勻并短暫離心；
? 反應液應避光保存；
? 反應中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；
? 使用一次性吸頭、一次性手套和各區專用工作服；
? 樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區進行，以免交叉污染；
? 實驗完畢后用10%次氯酸或75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；
? 試劑盒里所有物品應視為污染物對待，并按照《微生物生物醫學實驗室生物安全通則》進行處理。
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