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Ni瓊脂糖凝膠說(shuō)明書(shū)

Ni-Agarose Resin for 6×His-Tagged Proteins 

目錄號(hào)：  K0010       

保    存：  20%乙醇中          2-8℃保存 

組分說(shuō)明 

                     Cat.No.        K0010A         K0010C

                     Volume           10ml         100ml

產(chǎn)品簡(jiǎn)介

      該鎳柱純化系統(tǒng)對(duì)6×His-tag 蛋白具有顯著特異吸附能力，能夠高效一步純化帶有 6 個(gè)組氨酸親和標(biāo)簽的蛋白。該系統(tǒng)具有4 個(gè) Ni2+ 螯合位點(diǎn)，較只有3 個(gè)螯合位點(diǎn)的Ni-IDA 結(jié)合Ni2+更為牢固，有效防止純化過(guò)程中Ni2+脫落且增強(qiáng)對(duì)His 標(biāo)簽蛋白的結(jié)合能力，提高純化效率。較高的基團(tuán)密度，大大提高了蛋白載量。該系統(tǒng)在天然或變性條件下，對(duì)來(lái)源于各種表達(dá)系統(tǒng)（如桿狀病毒，哺乳細(xì)胞，酵母以及細(xì)菌）中的 His 標(biāo)簽蛋白，均有很好的純化效果。本產(chǎn)品已螯合鎳離子，可直接使用，方便，快捷。

支持物：CL-6B 瓊脂糖凝膠

      載量：20-30mgHis標(biāo)簽蛋白/ml 填料

      粒徑：50-160μm

注意事項(xiàng) 

 1. 緩沖液中不建議使用β-巰基乙醇、DTT 和EDTA。

 2. 整個(gè)純化過(guò)程中切忌凝膠脫水變干。

 3. 為提高純化效率，首先確定BindingBuffer 和  ElutionBuffer 中咪唑的最-#佳使用濃度。可以使用線(xiàn)性或梯度濃度的咪唑（20-500mM）洗脫蛋白，并通過(guò)SDS-PAGE 或 WesternBlotting 來(lái)檢測(cè)目的蛋白的純度。

 4. 請(qǐng)使用高純度的試劑配制緩沖液，并通過(guò)0.45µm 過(guò)濾器過(guò)濾。為避免柱子被堵塞，建議將裂解液進(jìn)行離心，或者使用 0.45µm 過(guò)濾器過(guò)濾。

 5. 柱再生時(shí)，保證每步洗完后都要用足夠的去離子水沖洗至中性。

操作步驟 

組裝層析柱 

 1. 將填料混勻后加入層析柱，室溫靜置10 分鐘，待凝膠與溶液分層后，把底部的出液口打開(kāi)，讓乙醇通過(guò)重力作用緩慢流出。

 注意：（1）填料的上層是乙醇保護(hù)層，將填料和乙醇一起混勻，以每ml填料純化20-30mgHis標(biāo)簽蛋白計(jì)算，取需要的填料與乙醇的混合液加入層析柱。

（2）如果乙醇不流出，可以給柱子一個(gè)外力，例如用大拇指對(duì)柱口輕輕按壓一下，迫使乙醇流出。                                                        

（3）本實(shí)驗(yàn)都是通過(guò)重力作用使溶液流出。

 2. 向裝填好的柱中加入5 倍柱體積的去離子水將乙醇沖洗干凈后，再用 10 倍柱體積的Binding Buffer  平衡柱子，平衡結(jié)束后即可上樣。

 注意：柱體積指的是填料的體積。

I  可溶性蛋白的純化（SolubleBindingBuffer和SolubleElutionBuffer配方詳見(jiàn)附表1） 

 1.  收集菌體后，每100mg菌體（濕重）加入1-5 ml細(xì)菌裂解液，超聲裂解菌體。

 2.  將菌體裂解液負(fù)載上柱，流速為10倍柱體積/小時(shí)。

 3.  使用15倍柱體積的Soluble Binding Buffer沖洗柱子，收集流穿峰。

 4.  使用5倍柱體積的Soluble Elution Buffer洗脫，收集洗脫峰。

 5.  洗脫后，依次使用3倍柱體積的Soluble Binding Buffer和5倍柱體積的去離子水洗滌柱子，再用3倍柱體積的20%乙醇平衡（乙醇要將填料浸沒(méi)），4℃保存。

II  包涵體蛋白的純化（InclusionBodyBindingBuffer和 InclusionBodyElutionBuffer配方詳見(jiàn)附表2） 

 1. 收集菌體后，每100mg菌體（濕重）加入1-5 ml  細(xì)菌裂解液，超聲裂解菌體。

 2. 離心，棄上清，將沉淀重懸于Soluble Binding Buffer中（如有需要，可進(jìn)行超聲波處理，超聲前可加入1-5mM磷酸酶抑制劑混合物）。

 3. 重復(fù)操作2，直至包涵體清洗干凈（呈較潔凈的乳白色狀）。

 4. 將沉淀重懸于Inclusion BodyBinding Buffer中，冰浴1小時(shí)，使包涵體溶解。

 5. 10,000×g離心20分鐘，將上清以孔徑為0.45 μm的濾膜過(guò)濾。

 6. 將蛋白溶液負(fù)載上柱，流速為10倍柱體積/小時(shí)。

 7. 使用15倍柱體積的Inclusion BodyBinding Buffer沖洗柱子，收集流穿峰。

 8. 使用5倍柱體積的Inclusion Body Elution Buffer洗脫，收集洗脫峰。

 9. 洗脫后，依次使用3倍柱體積的Inclusion BodyBinding Buffer和5倍柱體積的去離子水洗滌柱子，再用3倍柱體積的20%乙醇平衡（乙醇要將填料浸沒(méi)），4℃保存。

     注意：在純化包涵體蛋白時(shí)，所有緩沖液均含有變性劑，需要降低 BindingBuffer 中的咪唑濃度（5mM 或更低）。洗脫時(shí)，若蛋白在較高pH下洗脫失敗，可以選用低 pH 緩沖液作為洗脫緩沖液（pH6.5，pH5.9 或 pH4.5）。 柱再生 當(dāng)填料使用多次后，結(jié)合效率會(huì)有所下降（表現(xiàn)為流速變慢或填料失去藍(lán)綠色），可以用以下方法再生，提高填料的使用壽命和蛋白質(zhì)的結(jié)合效率。

 1. 使用2 倍柱體積的6M  鹽酸胍沖洗后，使用3 倍柱體積的去離子水沖洗。

 2. 使用 1 倍柱體積2% SDS 沖洗。

 3. 依次使用 1 倍柱體積的25%、50%、75%和5 倍柱體積100%乙醇沖洗，再依次使用 1 倍柱體積的75%、50%、25%的乙醇沖洗。

 4. 使用 1 倍柱體積的去離子水沖洗。

 5. 使用 5 倍柱體積含50 mM EDTA 緩沖液（PH8.0）沖洗。

 6. 使用 3 倍柱體積去離子水，3 倍柱體積20%乙醇沖洗。

 7. 4°C 保存。

 8. 再次使用前，需首先使用10 倍柱體積去離子水沖洗，然后使用5 個(gè)柱體積的      50 mM NiSO4再生，3 個(gè)柱體積的Binding Buffer   平衡。

 1: 蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)  

（分子量由大到小分別為：90/66/45/27/  14.4kDa）

2: 全菌裂解液

 3: 流穿收集液

 4: 洗脫收集液    

1（洗脫緩沖液，含     500mM   咪唑，收集第1 個(gè)柱體積）

 5: 洗脫收集液

2（洗脫緩沖液，含 500mM 咪唑，收集第 2 個(gè)柱體積）

 6: 洗脫收集液

3（洗脫緩沖液，含500mM咪唑，收集第3 個(gè)柱體積）

7: 洗脫收集液

 4（洗脫緩沖液，含500mM 咪唑，收集第 4 個(gè)柱體積）

 附表 

 附表  1. 可溶性蛋白純化緩沖液配方

                                                         

成分                    Tris-HCl（PH7.9）   咪唑            NaCl

SolubleBindingBuffer              20mM      10mM       0.5M

SolubleElutionBuffer              20mM        500mM     0.5M



    

附表  2. 包涵體蛋白純化緩沖液配方

 成分                 Tris-HCl（PH7.9）    咪唑    NaCl     尿素/鹽酸胍

InclusionBodyBindingBuffer      20mM     5mM  0.5M    8M/6M

InclusionBodyElutionBuffer       20mM   500mM   0.5M    8M/6M

    

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